Orobanche cumana Wallr., agente causal del jopo de girasol Rocío Pineda Martos1, Antonio J. Pujadas Salvà



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Caracterización molecular de poblaciones de Orobanche cumana Wallr., agente causal del jopo de girasol
Rocío Pineda Martos1, Antonio J. Pujadas Salvà2, Juan Domínguez3, M. Leire Molinero Ruiz1

1Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Apdo. 4084, 14080 Córdoba, España, g02pimar@uco.es, ag2morum@uco.es

2 Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales, Campus de Rabanales, Edificio C-4 “Celestino Mutis”, Ctra. de Madrid, km 396, 14071 Córdoba, España, cr1pusaa@uco.es

3 Producción Agraria, IFAPA Centro Alameda del Obispo, Apdo. 3092, 14080 Córdoba, España, juan.dominguez.jimenez@juntadeandalucia.es

ABSTRACT

Sunflower (Helianthus annuus L.) is the most important annual oilseed crop in Spain and broomrape (Orobanche cumana Wallr.) is a severe constraint to the production. The highly virulent race of this parasitic weed, race F, is frequently found in the country. Different levels of aggressiveness in populations of race F of O. cumana have been reported. Aiming at studying the possible diversity within race F of O. cumana, a molecular and phenotypical characterization of populations was conducted. Populations collected in sunflower fields from Spain (Córdoba, Sevilla and Cuenca) and Turkey between 1999 and 2002 were characterized through inoculation of sunflower inbred lines carrying resistance to broomrape. Molecular RAPD-PCR analyses were performed between and within populations of the parasitic weed. Phenotypical results allowed the identification of populations from Spain as race E or F and showed the existence of races F and G in Turkey. These results also suggested a diversity of components with different inherent virulence within some of the populations. The molecular analyses grouped the samples according to the geographic origin. Besides, a high genetic homogeneity among and within samples of O. cumana was revealed. No differences between samples from the same population collected onto different resistant sunflower cultivars were found. The genetic homogeneity of populations of O. cumana race F agrees with horizontal resistance of sunflower cultivars to this race as previously reported.


Key words: Broomrape – genetic control – Helianthus annuus L. – molecular characterization – RAPD-PCR – sunflower

RESUMEN


El girasol (Helianthus annuus L.) es el cultivo oleaginoso anual más importante en España, y el jopo (Orobanche cumana Wallr.) es una importante limitación de la producción. La raza más virulenta de la planta parásita, raza F, es frecuente en el país. Se han referido poblaciones de esta raza que difieren en agresividad. Con el fin de estudiar la posible diversidad dentro de la raza F de O. cumana, se llevó a cabo una caracterización fenotípica y molecular de poblaciones. Éstas se recogieron en campos de girasol de España (Córdoba, Sevilla y Cuenca) y de Turquía entre 1999 y 2002 y se caracterizaron fenotípicamente por inoculación de líneas puras de girasol con resistencia a jopo. Se efectuaron análisis moleculares dentro de y entre poblaciones de la planta parásita mediante RAPD-PCR. Los resultados fenotípicos permitieron la identificación de las razas E y F en las poblaciones de España y mostraron la existencia de las raza F y G en Turquía. Los resultados también sugirieron una diversidad de componentes con diferentes virulencias dentro de poblaciones de O. cumana. El análisis molecular agrupó las muestras en función de su origen geográfico. Además, la homogeneidad genética dentro de y entre muestras de O. cumana raza F fue elevada. No se obtuvo diversidad genética entre muestras de poblaciones recogidas sobre distintos cultivares de girasol resistentes. La homogeneidad de poblaciones de O. cumana raza F concuerda con la resistencia horizontal de cultivares de girasol a la raza F previamente referida.
Palabras clave: Caracterización molecular – control genético – girasol – Helianthus annuus L. – jopo – RAPD-PCR

INTRODUCCIÓN

El jopo de girasol (Orobanche cumana Wallr.) es una planta angiosperma holoparásita desprovista de clorofila y de actividad fotosintética, que penetra en los tejidos vasculares de las raíces del girasol y obtiene de ellos tanto el agua como los nutrientes necesarios para completar su ciclo vital (Nickrent, 2001). Programas de mejora de girasol para resistencia a la enfermedad, dieron lugar al desarrollo de híbridos resistentes pero también aparecieron nuevos patotipos que sobrepasaban esta resistencia (Melero-Vara et al., 1989). Se ha descrito la existencia de seis razas distintas de O. cumana (A a F), de virulencia progresivamente mayor. Cada una de las razas A a E está controlada por un gen dominante: Or1 a Or5, que aporta además resistencia a las razas anteriores (patrón de resistencia acumulativo) (Vrânceanu et al., 1980). En el caso de la raza F, la más virulenta, la resistencia parece estar también condicionada por genes menores y no es siempre efectiva frente a razas menos virulentas (Pérez-Vich et al., 2004; Molinero-Ruiz et al., 2006). Además, se han identificado diversas agresividades dentro de poblaciones de O. cumana de la raza F (Molinero-Ruiz y Melero-Vara, 2004). El empleo de los marcadores RAPD resulta muy útil para distinguir unas especies de otras dentro del mismo género, y también son particularmente efectivos para discriminar entre diferentes aislados, poblaciones, ecotipos, etc. dentro de una misma especie (Williams et al., 1990). Un conocimiento profundo de la estructura poblacional y racial de O. cumana tanto a nivel fenotípico como a nivel molecular resulta necesario en el diseño de nuevas estrategias de control del patógeno que resulten más sostenibles y duraderas. Por ello, los objetivos de este trabajo han sido los siguientes: identificación fenotípica de poblaciones de O. cumana supuestamente pertenecientes a la raza F, análisis molecular mediante RAPD-PCR dentro de poblaciones de O. cumana de raza F y análisis molecular mediante RAPD-PCR entre poblaciones de O. cumana.



MATERIALES Y MÉTODOS

Reacción de genotipos de girasol a poblaciones de O. cumana

Se llevaron a cabo dos experimentos bajo condiciones de invernadero. En los dos se inocularon tres líneas puras de girasol resistentes a las razas E y/o F de jopo: P96, resistente a las razas E y F; NR5 resistente a la raza E pero susceptible a la raza F y L86, resistente a la raza F y susceptible a la E (Molinero-Ruiz et al., 2006).

Las diferentes poblaciones se recogieron en distintas zonas geográficas de España y Turquía, entre los años 1999 y 2002. Con cada una de las poblaciones se inocularon artificialmente nueve y ocho plántulas (repeticiones) de cada una de las líneas, en los experimentos 1 y 2, respectivamente. Las inoculaciones se llevaron a cabo sobre las plántulas trasplantadas a 175 g de una mezcla de suelo (arena:limo, 1:1, vol) uniformemente infestada con 18 mg de semillas de jopo. Las plantas crecieron bajo condiciones controladas de temperatura (20-25C) y fotoperiodo de 14 h día-1 durante 14 días. Transcurrido este tiempo, se trasplantaron con el sustrato infestado a macetas de 5 L conteniendo la mezcla de suelo anteriormente descrita y creciendo bajo condiciones de invernadero (10-32C) durante 14 semanas hasta alcanzar su madurez fisiológica.

Desde la emergencia de la primera planta de jopo y hasta la madurez fisiólogica de las plantas de girasol, se anotó semanalmente el grado de ataque, expresado como número medio de plantas de jopo por planta de girasol. Al finalizar cada experimento se anotó el grado de ataque final o número de jopos final (NFJ) en cada línea de girasol y población de jopo, y esta variable se analizó mediante análisis de varianza (ANOVA). Cuando el ANOVA arrojó diferencias significativas entre poblaciones, entre líneas o en la interacción entre ambos factores, se llevó a cabo la comparación de medias según el test LSD (Mínima Diferencia Significativa) protegido de Fisher al nivel de probabilidad del 5%.


Caracterización molecular de poblaciones de O. cumana mediante RAPD-PCR

Los análisis de diversidad intrapoblacional se llevaron a cabo con 12 muestras de ADN de O. cumana correspondientes a cuatro poblaciones recogidas sobre los cultivares B117 (susceptible universal), NR5, L86 ó P96. Los análisis de diversidad interpoblacional se llevaron a cabo con 35 muestras de O. cumana correspondientes a 33 poblaciones recogidas sobre el cultivar NR5 ó sobre B117. Las poblaciones procedían de España (Andalucía y Castilla La-Mancha) o Turquía.

Una vez emergidas las plantas de jopo, se tomaron muestras (ápices) de entre 25 y 30 plantas individuales de cada población para su posterior extracción de ADN. Los tejidos recogidos se congelaron a -80C hasta que fueron liofilizados. Se utilizó el kit de extracción de ADN genómico DNA Mini-prep Kit (Dominion-MBL SL, Córdoba, España), con el que en cada muestra se extrajo el ADN de 1-4 plantas de jopo.

Inicialmente, se ensayaron 115 cebadores 10-mer de secuencia aleatoria con 8 muestras de jopo. Se seleccionaron 32 por amplificar todas las muestras. Las reacciones RAPD-PCR se efectuaron según el protocolo de Williams et al. (1990) llevado a cabo con ligeras modificaciones. Los patrones obtenidos se analizaron en base a la presencia/ausencia de polimorfismos de interés. A partir de los datos moleculares se generó una matriz binaria combinada. Se calculó el coeficiente de similitud de Jaccard y se elaboró un dendograma de las distancias matriciales con el método UPGMA.



RESULTADOS

Reacción de genotipos de girasol a poblaciones de O. cumana

El análisis de varianza del NFJ en el experimento 1, mostró diferencias significativas entre líneas y en la interacción línea y población (P<0.0001 en ambos casos). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las poblaciones de jopo evaluadas. Al efectuar la comparación de medias de NFJ entre líneas, los tres valores fueron significativamente distintos entre sí y variaron entre 0.2 y 16.2 jopos/planta (en el caso de P96 y NR5, respectivamente) (Tabla 1). Los resultados confirmaron que todas las poblaciones de O. cumana excepto CU200, tenían una virulencia superior a E, por la susceptibilidad observada en la línea pura NR5 (Tabla 1).


Tabla 1. Grado de ataque de O. cumana causado por distintas poblaciones de la planta parásita en tres líneas de girasol con diferente resistencia y expresado como número final de plantas de jopo/planta de girasol. Experimento 1.

Población



Genotipo




NR5

L86

P96

CU200

0.13 ± 0.131

9.25 ± 2.96

0.00 ± 0.00

LR100

19.38 ± 3.17

0.13 ± 0.13

0.00 ± 0.00

CO101

14.13 ± 3.38

0.88 ± 0.64

0.63 ± 0.63

PA101

10.88 ± 3.48

9.88 ± 2.58

1.38 ± 0.53

AA702

17.38 ± 4.32

0.00 ± 0.00

0.00 ± 0.00

JC302

22.63 ± 3.87

0.38 ± 0.26

0.00 ± 0.00

LG602

20.25 ± 3.83

0.63 ± 0.42

0.00 ± 0.00

SP102

23.00 ± 3.53

0.38 ± 0.18

0.00 ± 0.00

TP402

Promedio


18.25 ± 3.24

2.75 ± 1.53

0.00 ± 0.00

16.22 a2

2.69 b

0.22 c

1Los valores corresponden al promedio de nueve repeticiones del NFJ por planta de girasol ± error estándar.

2Diferentes letras muestran diferencias significativas (P=0.05) entre líneas de girasol.
En el experimento 2, el análisis de varianza del NFJ mostró diferencias significativas entre las distintas líneas y entre las poblaciones de jopo (P<0.0001 en ambos casos). También la interacción entre ambas variables fue significativa (P= 0.0005). Al efectuar la comparación de medias de NFJ entre líneas, los tres valores fueron significativamente distintos entre sí y variaron entre 1.7 y 10.3 jopos/planta (en el caso de P96 y NR5, respectivamente) (Tabla 2). La comparación de medias de NFJ entre poblaciones reveló que las poblaciones CES y MAL eran las más virulentas, con un NFJ de 13.1 y 12.3 jopos/planta respectivamente (Tabla 2).
Tabla 2. Grado de ataque de O. cumana causado por distintas poblaciones de la planta parásita en tres líneas de girasol con diferente resistencia y expresado como número final de plantas de jopo/planta de girasol. Experimento 2.

Población



Genotipo



Promedio


NR5

L86

P96

CO1002

20.83 ± 5.641

4.33 ± 4.33

0.00 ± 0.00

8.39 bc2

CU1102

0.00 ± 0.00

9.50 ± 1.34

0.00 ± 0.00

3.17 d

MN802

12.33 ± 3.31

0.67 ± 0.33

0.00 ± 0.00

4.33 cd

BEY

0.17 ± 0.17

2.00 ± 1.61

0.00 ± 0.00

0.72 d

HAY

2.50 ± 0.50

0.50 ± 0.34

0.00 ± 0.00

1.00 d

MUR

10.33 ± 3.68

3.33 ± 1.43

0.67 ± 0.49

4.78 cd

CES

21.33 ± 4.82

13.17 ± 3.32

4.83 ± 1.45

13.11 a

MAL

14.83 ± 5.57

14.17 ± 4.84

7.83 ± 3.22

12.28 ab

Promedio

10.29 a2

5.96 b

1.67 c




1Los valores corresponden al promedio de ocho repeticiones del NFJ por planta de girasol ± error estándar.

2Diferentes letras muestran diferencias significativas (P=0.05) entre poblaciones y entre líneas de girasol.
Caracterización molecular de poblaciones de O. cumana mediante RAPD-PCR

Análisis de la diversidad intrapoblacional de O. cumana:



Del conjunto de los 32 cebadores seleccionados, se observaron polimorfismos en las muestras al analizar 21 de ellos, los cuales amplificaron un total de 39 bandas polimórficas intensas y reproducibles. Cuatro cebadores amplificaron bandas en las muestras de jopo de Cuenca y de Turquía pero no en las de Andalucía. En el caso de estas últimas, se obtuvo una banda polimórfica exclusiva en la amplificación con otro de los cebadores utilizados. Por otro lado, en el caso de las muestras de Cuenca, hubo dos cebadores que generaron una banda en ellas y no en las restantes.

El dendograma obtenido diferenció tres grupos en las muestras. En el grupo I se localizaron todas las muestras procedentes de Cuenca con un 89% de similitud entre ellas. En el grupo II se localizaron todas las muestras procedentes de Turquía con un 91.5% de similitud. En el grupo III se englobaron las muestras de Andalucía con 93.5% de similitud entre ellas. A su vez, los grupos II y III mostraron un 90% de similitud entre ambos y un 84.5% con el grupo I (Figura 1).


Fig. 1. Dendograma obtenido del análisis RAPD de 12 muestras de ADN de O. cumana obtenidas de 4 poblaciones de la planta parásita y 4 cultivares de girasol. La escala superior representa los porcentajes de similitud según el coeficiente de similitud de Jaccard. Los valores en los nodos representan valores bootstrap mayores de 50 para 100 repeticiones.
Análisis de la diversidad interpoblacional de O. cumana:

Del conjunto de los 26 cebadores utilizados, se observaron polimorfismos con 17 de ellos, los cuales amplificaron un total de 71 bandas polimórficas intensas y reproducibles. Uno de ellos amplificó dos bandas en el caso de las muestras de Cuenca y de Turquía, así como una banda exclusiva de las poblaciones originarias de Andalucía. Otro de los cebadores utilizados amplificó dos bandas polimórficas que se asociaron sólo a las muestras de Andalucía. Otros dos cebadores amplificaron bandas exclusivas de las muestras de Andalucía y de Turquía. Por último, uno de los cebadores utilizados amplificó una banda única que permitió identificar las muestras de Cuenca.

En el dendograma obtenido se diferenciaron tres grupos en las muestras (Figura 2). En el grupo I se localizaron todas las muestras procedentes de Andalucía con un 87% de similitud entre ellas. En el grupo II se localizaron todas las muestras procedentes de Turquía con un 87% de similitud entre ellas. En el grupo III se agruparon las muestras de Cuenca con un porcentaje de similitud entre ellas del 91%. Los grupos I y II fueron similares en un 84% y a su vez, el grupo III se relacionó con los anteriores con un porcentaje de similitud del 82% (Figura 2). No se observó ninguna tendencia en la agrupación de las muestras de ADN analizadas en función del cultivar de H. annuus sobre el que se hubieran tomado las plantas de jopo (B117 ó NR5).


Fig. 2. Dendograma obtenido del análisis RAPD de 35 muestras de ADN de O. cumana obtenidas de 33 poblaciones de la planta parásita y 2 cultivares de girasol. La escala superior representa los porcentajes de similitud según el coeficiente de similitud de Jaccard. Los valores en los nodos representan valores bootstrap mayores de 50 para 100 repeticiones.

DISCUSIÓN

La superación de la resistencia de NR5 y L86 por la población PA101 (experimento 1), pudo ser debida a que la población fuera de la raza G –al haberse encontrado plantas de jopo de dicha población también sobre la línea P96– o bien a que se tratara de una población de raza F heterogénea con componentes de virulencia superior (G). Los resultados de la caracterización fenotípica apoyaron la segunda hipótesis, pues el número de plantas de jopo en P96 fue significativamente menor que en NR5 y L86. Sin embargo, los resultados del análisis molecular intrapoblacional revelaron que el ADN de plantas de jopo de la población PA101 recogidas sobre los cultivares NR5, L86 y P96 era similar en más de un 93% y se diferenció claramente del de las otras tres poblaciones analizadas. Por tanto, las plantas de jopo en P96 podrían ser debidas al carácter cuantitativo de la resistencia de esta línea a la raza F, como ya ha sido sugerido (Pérez-Vich et al., 2006; Molinero-Ruiz et al., 2006).

La línea NR5 fue susceptible a cinco de las poblaciones evaluadas confirmando que su virulencia era superior a E (experimento 2). Cuatro de ellas fueron de la raza F, por ser controladas de forma efectiva por P96 (CO1002, MN802, MUR y CES). Sin embargo, las tres líneas de girasol inoculadas fueron igual de susceptibles a la población MAL, indicando que ésta podría ser una nueva raza de jopo (G) por superar la resistencia tanto de L86 como de P96 a la raza F. La existencia de poblaciones de jopo de elevada virulencia en Turquía ya ha sido sugerida previamente (Kaya et al., 2004). Los resultados del análisis molecular intrapoblacional diferenciaron claramente las muestras procedentes de la población MAL frente a las restantes –las de Cuenca y de Andalucía–, agrupándolas entre sí con un 91.5% de similitud. En el caso de CU1102 (Cuenca), no se observó emergencia de plantas de jopo en NR5 ni en P96, pero sí, y de forma significativamente mayor, en L86, lo que nos hizo identificar esta población como raza E. Esta identificación fenotípica está apoyada por los resultados moleculares, ya que en el análisis interpoblacional se agrupó con todas las muestras de Cuenca –varias de ellas de raza E–.

Finalmente, el escaso número de plantas de jopo observado tanto en NR5 como en L86 y en P96 al ser inoculadas con las poblaciones BEY y HAY pudo ser debido a una pérdida de vigor de éstas, cuyas semillas se recogieron en 1999. De hecho, la pérdida de vigor de semillas de O. cumana almacenadas en oscuridad a temperatura ambiente durante 5-6 años ha sido recientemente referida (Molinero-Ruiz et al., en prensa).

Las diferencias genéticas encontradas a nivel molecular entre poblaciones de jopo no fueron muy elevadas pero sí demostraron la diferenciación de las poblaciones en función del origen geográfico –Turquía, Cuenca o Andalucía– pero no del cultivar de girasol sobre el que se hubiesen recogido (B117 ó NR5). Estos resultados coinciden con los expuestos por Gagne et al. (1998), quienes estudiaron la diversidad genética de poblaciones de O. cumana procedentes de distintos orígenes geográficos (Bulgaria, Rumanía, Turquía y España) y encontraron que los grupos definidos eran independientes de los genotipos de girasol huéspedes, sugiriendo grupos según razas.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la financiación del trabajo por parte de la Fundación Ramón Areces (XIII Concurso Nacional para la Adjudicación de Ayudas a la Investigación Científica y Técnica) y por el proyecto MEC-INIA RTA2004-048.



REFERENCIAS

Gagne, G., P. Roeckel-Drevet, B. Grezes-Besset, P. Shindrova, P. Ivanov, C. Grand-Ravel, F. Year, D. Tourvieille de Labrouhe, G. Charmet, and P. Nicolas. 1998. Study of the variability and evolution of Orobanche cumana populations infesting sunflower in different european countries. Theor. Appl. Genet. 96: 1216-1222.

Kaya, Y., M. Demirci, and G. Evci. 2004. Sunflower (Helianthus annuus L.) breeding in Turkey for broomrape (Orobanche cernua Loeffl.) and herbicide resistance. Helia 27: 199-210.

Melero-Vara, J.M., J. Domínguez, and J.M. Fernández-Martínez. 1989. Evaluation of differential lines and a collection of sunflower parental lines for resistance to broomrape (O. cernua) in Spain. Plant Breed. 102: 322-326.

Molinero-Ruiz, M.L. and J.M. Melero-Vara. 2004. Virulence and aggressiveness of sunflower broomrape populations (Orobanche cumana) overcoming the Or5 gene. p. 165-169. In: Proc. 16th Int. Sunfl. Conf., Fargo, ND, USA. Int. Sunfl. Assoc., Paris, France.

Molinero-Ruiz, M.L., J.M. Melero-Vara, and R. García-Ruiz. 2006. Pathogenic diversity within field populations of Orobanche cumana and different reactions on sunflower genotypes. Weed Res. 46: 462-469.

Molinero-Ruiz, M.L., B. Pérez-Vich, R. Pineda-Martos, and J.M. Melero-Vara. Indigenous highly virulent accessions of the sunflower root parasitic weed Orobanche cumana. Weed Res. (en prensa).

Nickrent, D. L. 2001. Plantas parásitas en el mundo. P. 7-27. In: J.A. López-Sáez, P. Catalán, and L. Sáez (ed.), Plantas parásitas de la Península Ibérica e Islas Baleares. Mundi-Prensa. Madrid.

Pérez-Vich, B., L. Velasco, J. Muñoz-Ruz, J. Domínguez, and J.M. Fernández-Martínez. 2006. Registration of three sunflower germplasms with quantitative resistance to race F of broomrape. Crop Sci. 46: 1406-1407.

Pérez-Vich, B., B. Akhtouch, S.J. Knapp, A.J. Leon, L. Velasco, J.M. Fernández-Martínez, and S.T. Berry. 2004. Quantitative trait loci for broomrape (Orobanche cumana Wallr.) resistance in sunflower. Theor. Appl. Genet. 109: 92-102.



Vrânceanu, A.V., V.A. Tudor, F.M. Stoenescu, and N. Pirvu. 1980. Virulence groups of Orobanche cumana Wallr., differential hosts and resistance source genes in sunflower. p. 74-82. In: Proc. 9th Int. Sunfl. Conf., Torremolinos, Málaga. Int. Sunfl. Assoc., Paris, France.

Williams, J.G.K., A.R. Kubelic, K.J. Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535.


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