Luis Fuentes L.*, Alvaro Gutiérrez*, Teresita Somogyi



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INVESTIGACION POR VIRUS DE LA HEPATITIS B

Y CITOMEGALOVIRUS EN DONADORES DE SANGRE

Luis Fuentes L.*, Alvaro Gutiérrez*, Teresita Somogyi*




RESUMEN





En un estudio de 783 donadores altruistas, se realizó el análisis de transaminasas séricas y la determinación del antígeno de superficie para la hepatitis tipo B (HBsAg). En 83 donadores, (10.6%) se demostró elevaciones de los valores de las transaminasas séricas, que oscilaron en­tre 1.3 y 3.8 veces lo normal, y únicamente se demostró positividad para el HBsAg en dos (0.25%) del total de las muestras analizadas, lo que concuerda con lo reportado en la literatura.

A 198 personas del estudio se les practicó cul­tivos para citomegalovirus (CMV) en la orina, secresión faríngea y en un concentrado de leu­cocitos, no lográndose el aislamiento del virus en ningún caso; sin embargo, se demostró la presencia de virus herpes tipo I en el cultivo faríngeo de 4 de estos donadores [Rev. Cost. Cienc. Med. 1987; 8(2):61-64].

INTRODUCCION

Las infecciones por citomegalovirus (CMV) pue­den dar lugar a diversas manifestaciones que dependen de la edad, el estado físico del pacien­te, así como si se trata de una infección primaria o latente (22). Inicialmente, sólo se diagnosti­caba esta enfermedad de manera retrospectiva, por el hallazgo de grandes células epiteliales, en las autopsias con inclusiones nucleares y citoplasmáticas en las glándulas salivales, el hí­gado, el bazo, los pulmones, los riñones, a veces en el cerebro, y también por los resultados de las encuestas seroepidemiológicas (2, 6, 8, 9, 15, 19). Actualmente, se dispone de recursos que permiten diagnosticar la enfermedad “in vivo”, lo que ha adquirido gran importancia por su relación con las transfusiones masivas de sangre, la terapéutica inmunosupresora, las in­fecciones congénitas y los transplantes de riñón (3, 7, 10, 13, 17, 21, 22). La infección oculta es común durante la infancia y la adolescencia, pero la mayor parte de las defunciones se pre­sentan en niños menores de dos años (15).

* Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San

José, Costa Rica.


La hepatitis viral aguda es una de las enferme­dades transmisibles más importantes. Sus agentes etiológicos más frecuentes son los virus A y B (11, 18). El hígado puede infectarse por otros virus en algunas enfermedades generali­zadas (12). En este grupo se puede incluir el citomegalovirus (23), el cual se aisla con fre­cuencia de niños, a veces con enfermedad he­pática, demostrándose también un aumento en los títulos de anticuerpos fijadores de comple­mento. Asimismo, se ha demostrado una fre­cuencia elevada de problemas hepáticos en pa­cientes asintomáticos con viruria por citomega­lovirus (14). En algunos pacientes con hepatitis colestásica o anictérica, de los que se aisla el citomegalovirus de la orina, se asocia un au­mento de anticuerpos fijadores de complemento contra citomegalovirus. Por otro lado, las prue­bas funcionales hepáticas anormales e ictericia, son los signos presentes en la “mononucleosis por citomegalovirus”. Así se ha establecido en­tonces, una relación causal entre el citomegalo­virus y ciertas enfermedades del hígado (4).

La incidencia de hepatitis postranfusional en pa­cientes con transaminasa glutámico pirúvica (TSGP) aumentada, ha sido demostrada, a pe­sar de ser éste un marcador no específico, y se ha relacionado con la transmisión del virus de la hepatitis no-A no-B (1, 16), en aquellos casos en que se ha descartado la infección por virus B. Aproximadamente un 40 por ciento de estas hepatitis no-A no-B se asocia con sangre prove­niente de donadores que han presentado valo­res de TSGP mayores de 45 Ul/1 (1, 5, 16). Al existir portadores asintomáticos de citomegalo­virus que producen hepatitis en pacientes poli­transfundidos o sometidos a cirugía extensa y voluminosas transfusiones de sangre: se hace necesario demostrar su presencia en estos por­tadores, a través del cultivo de secreciones na­sofaringeas y arma, o, descartar el riesgo de­mostrando anticuerpos circulantes contra el vi­rus.



MATERIAL Y METODOS

El estudio incluyó 783 donantes voluntarios de


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sangre, aparentemente sanos, con edades que oscilaron entre 23 y 36 años; anictéricos, sin historia de hepatitis viral clínica y asintomáticos al momento de a toma de la muestra. De todos se obtuvo una muestra de sangre y a 198 de ellos se les recogió muestras de orina y frotis faríngeo para el estudio virológico.

Se recogió muestras de orina, previa una lim­pieza rigurosa, directamente en un frasco estéril. De inmediato se colocaron a 42º C, donde perma­necieron unas dos horas antes de ser traslada­das en frío al laboratorio, para su procesamien­to. Después de una centrifugación a 1000 r.p.m. por 10 minutos el infranadante suspendido fue ajustado a pH 7.0 con NaOH 0,1 N e inoculado a razón de 0,2 ml en capas preformadas de células WI, previamente drenadas de su medio de crecimiento. Después de 1 hora de adsorción, cada tubo recibió 1,5 mI de medio mínimo esen­cial de Eagle (MEM).

Se tomó un frotis faríngeo con ayuda de un hi­sopo de algodón no absorbente, el cual se hu­medeció y exprimió en 2 ml de medio de trans­porte constituido por solución salina de Hanks adicionada de gelatina al 0,5 por ciento y 800 unidades de penicilina y poIimixina B, 50 u. de micostatín y 800 mg de streptomicina. Las muestras se mantuvieron a 4º C por dos horas antes de ser conducidas al laboratorio para su procesamiento. Después de ser sometidas a centrifugación por 10 mm. a 1000 r.p.m., el so­brenadante se inoculó a razón de 0,2 ml sobre capas preformadas de células WI crecidas en tubos de cultivo, que habían sido drenadas de su medio de crecimiento. El inóculo se adsorbió por 1 hora a temperatura ambiente y luego cada monocapa se realimentó con 1,5 ml de medio MEM de mantenimiento.

Se tomó 10 ml de sangre que se dividió en dos porciones: una en heparina y otra sin anticoagu­lante. Las sangres fueron mantenidas en frío durante la recolección y su transporte al labora­torio. La sangre heparinizada fue resuspendida y se trató con Ficol-Hypaque para la separación de leucocitos. Los leucocitos separados fueron tratados con Macrodex para la obtención de po­limorfonucleares. Luego se lavaron dos veces en solución salina de Hanks y después de cen­trifugación a 3.000 r.p.m. en frío, se les resus­pendió en 2 ml de medio MEM de mantenimien­to. Se inoculó 1,5 ml de esa suspensión sobre células WI y el resto se congeló a –70oC. Sin adsorción previa, los tubos se incubaron a 37oC durante 18 horas. Al día siguiente se eliminé el medio y se realimentó con MEM de manteni­miento.


Una porción de la sangre heparinizada se utilizó para realizar el hemograma completo.

La sangre coagulada, después de una adecuada retracción del coágulo se centrifugó a 1000 r.p.m. por 10 minutos y el suero se separó inme­diatamente. Una porción del suero se congeló a –30º C y la otra se empleó en las determinacio­nes de transaminasas.

Los cultivos inoculados se incubaron a 37º C, realizando cambio de medio cada 4-5 días. Las monocapas se observaron con un microscopio invertido tres veces por semana. Los cultivos se descartaron si permanecían negativos por un efecto citopático al cabo de 6 semanas.

Los sueros fueron escrutados por anticuerpos contra antígeno asociado a la hepatitis B me­diante el método de Reoforesis, CEP y ELISA.


Células: Se empleó la línea de células diploides Wi-36 crecidas en medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Las últimas 50 muestras fueron inoculadas en células diploides HEL, crecidas en el mismo medio.

Se prepararon monocapas de las células men­cionadas sembrando 100.000 células suspendi­das en 1 ml de medio de crecimiento en tubos de cultivo. Después de 2 a 3 días de incubación a 37º C se tenía una monocapa cerrada lista para inocular.


Medios de Cultivo: Se empleó durante el estu­dio el Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM de la casa Gibco). Para iniciar los cultivos el medio se complementé con suero fetal de ternero, a concentración final de 10 por ciento de bicarbonato de sodio al 0.11 por ciento, lo mismo que 100 unidades de penicilina y polimixina B, 25 u. de micostatín y 100 ug de streptomicina, El medio de mantenimiento redujo la concentra­ción de suero a 2 por ciento y aumentó el bicar­bonato a 0.22 por ciento manteniendo a la misma concentración los antibióticos y antimicó­ticos.

RESULTADOS

De los 783 sueros estudiados dos (0.25%) fue­ron positivos por antígeno asociado a hepatitis B. En 69 de los pacientes (8.8%) hubo elevacio­nes de transaminasas que no pasaron de 49 unidades (1.7 veces lo normal). Unicamente 14 (1.78%) de los 783 sueros analizados presenta­ron valores de transaminasa más elevados, en­contrándose para TSGP un promedio de 78.7 U (ámbito de 51-106) y para TSGO un promedio de 71.5 U (ámbito de 50-104 U). De estos 14



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sueros con transaminasas elevadas uno fue po­sitivo por antígeno de superficie para la hepatitis B (TSGP 84 U y TSGO 68 U). El otro donador positivo por HBs Ag presentó valores normales para las dos transaminasas.

En 198 de estas personas, potenciales donado­res de sangre, se obtuvo muestras para estudio por citomegalovirus, utilizando la técnica de ino­culación en capas preformadas de células Wi. Todos los cultivos fueron negativos por citome­galovirus pudiéndose detectar en 4 de los casos, la presencia de herpes virus tipo I a partir de los frotis faríngeos.



DISCUSION

Los valores obtenidos en las transaminasas y la positividad para el HBsAg son semejantes a los obtenidos para otras poblaciones en banco de sangre (E. Brilla, Comunicación personal) lo que demuestra que el grupo en estudio es típico y representativo de los donantes de sangre que se presentan a los hospitales, aunque tamizados a través de un detenido examen médico clínico. El utilizar en los bancos de sangre la determina­ción de TSGP como prueba de escrutinio para eliminar posibles donadores con hepatitis no-A no-B (1), hasta que se tenga una prueba sero­lógica certera para el diagnóstico de este tipo de hepatitis, debe ser discutida, pues se conoce que un alto porcentaje de las hepatitis postrans­fusionales no pueden prevenirse usando la de­terminación de TSGP como guía, y también se sabe que un alto porcentaje de donadores con niveles de TSGP elevados, no resulta en hepa­titis viral (18).

Debe evaluarse cuidadosamente si es conve­niente eliminar a todos aquellos donadores con niveles de transaminasa elevadas, quitando así grupos de donadores potenciales o bien el acep­tarlos tomando en cuenta el riesgo que repre­senta. Un estudio más completo para investigar hepatitis B en donadores, debe incluir determi­naciones de anticuerpo “core” de la hepatitis B (anti HBc) pues muchas veces este es el único marcador serológico que aparece en una sangre capaz de producir hepatitis postransfusional (5, 20, 24, 25, 26).

En virtud de los resultados obtenidos en los cul­tivos de muestras de orina, secresión faríngea y leucocitos, se concluye que para grupos de población como el descrito (edad y estado gene­ral de salud) la presencia de portadores asinto­máticos es despreciable. Esto limita el interés del complejo procedimiento para aislar el cito­megalovirus, a sangres de donadores muy cali-


ficados, ya que las posibilidades de aislamiento, o sea el riesgo de transmisión del virus por trans­fusión son mínimos y no justifica, según los re­sultados obtenidos, el elevado esfuerzo de su investigación.

AGRADECIMIENTO

El presente estudio pudo llevarse a cabo gracias a la colaboración en la obtención de muestras de los Drs. Ezequiel Vieto y Maximiliano Gutié­rrez, del Banco Nacional de Sangre y del Dr. Juan de Dios Cartín del Hospital Calderón Guar­dia.



ABSTRACT



Transfusion risk with hepatitis B and cytomega­loviruses has been pointed out. At present, the blood bank routine includes laboratory tests to detect hepatitis B, but cytomegalovirus has been excluded because of its high cost and its perfor­mance time. In this study, the sera of 783 blood donors were analyzed for transaminases quan­titation and type B hepatitis surface antigen (HBsAg) detection. Transaminase elevations from 1.3 to 3.8 times normal values were obser­ved in 83 donors. Only 2 donors (0.25%) were HbsAg positive, as has been similarly reported for other donor groups.

Cultures of CMV in urine, pharyngeal secretions and in leukocyte concentrate were performed in 198 subjects, but the virus was not isolated from any sample. However, herpes type 1 virus was found in four of the pharyngeal smears.


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